Maxima(R) Reverse Transcriptase

Maxima(R) Reverse Transcriptase

逆转录酶优化反应温度反应最高温度通读长度RNase H 活性失活Units/20 ul
总RNA用量/20 ul
MaximaTM Reverse Transcriptase50-55°C60°C20 kb+85°C, 5 min200 u0.01 ng - 5 ug
RevertAidTM Premium Reverse Transcriptase50-55°C60°C20 kb85°C, 5 min200 u0.01 ng - 5 ug
RevertAidTM H Minus Reverse Transcriptase42-45°C55°C13 kb– 70°C, 10 min200 u0.1 ng - 5 ug
RevertAidTM Reverse Transcriptase 42°C50°C13 kb+70°C, 10 min200 u0.1 ng - 5 ug
M-MuLV Reverse Transcriptase37°C37°C9 kb+70°C, 10 min40 u100 ng - 5 ug
AMV Reverse Transcriptase45-50°C60°C13 kb++85°C, 5 min10 u10 ng - 5 ug
 
  • 热失活85°C, 5 min - 热失活85°C, 5 min
  • 重组酶 - 重组酶
  • LO合格 - LO合格
  • -20°C保存 - -20°C保存
Catalog#Size, concentrationSupplied with:Certificate of Analysisprice
5X RT Buffer
EP0741 2000 u (200 u/ul) 1.00 ml EP0741  ¥450
EP0742 10,000 u (200 u/ul) 1.00 ml EP0742  ¥1450
EP0743 4 x 10,000 u (200 u/ul) 2 x 1.00 ml EP0743  ¥4600
Product information
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Features

  • 高通量地制备长达20 kb的全长cDNA。
  • 活性温度可高达60°C。
  • 热稳定 – 在50°C 的反应物中孵育 60 分钟仍有90%的活性。
  • 高效 – 15-30分钟全合成cDNA。
  • 高敏感度 – 以宽范围(0.01 pg – 5 μg)的起始RNA量可重复性地合成cDNA。
  • 可结合修饰的核苷酸。
Applications

  • 两步RT-PCR。
  • 两步RT-qPCR。
  • 第一链 cDNA合成。
  • 全长cDNA文库的构建。
  • DNA 标记。
  • 引物延伸。
说明
Maxima(R) Reverse Transcriptase由Fermentas 公司通过小鼠白细胞病毒逆转录酶(M-MuLV RT)的体外进化研发而成。该酶具RNA依赖和DNA依赖的聚合酶的活性以及核糖核酸酶H活性。该工程酶与野生型的M-MuLV RT相比,热稳定性,耐用性大大增强,并且合成效率也有所提高。

Maxima(R) Reverse Transcriptase能以宽范围(0.01 pg – 5 μg)的初始RNA量在提高的温度下(50-60°C)可重复性地合成cDNA,使之成为两步RT-qPCR的一个理想工具(见图5)。

由于它的高热稳定性(见图1),这个酶在整个逆转录反应过程中保持全效活性,合成高产量的cDNA,并且能合成长度长达20 kb的很长的 RNA转录片段(见图2)。反应温度也可以提高至60°C 以高效转录带有大量二级结构RNA区域或者采用基因特异性引物提高转录特异性。由于合成速度的提高,逆转录酶的反应能在15到30 分钟完成(见图4)。


来源
E.coli 细胞含有来源于Moloney Murine Leukemia病毒的基因工程化的pol基因片段。

活性单位定义
1个活性单位是指在37°C、10分钟内将1 nmol dTMP合成掺入多聚的核苷酸片段(吸附在DE-81上)所需的酶量。

酶活性分析混合物:50 mM Tris-HCl (pH 8.3), 4 mM MgCl2, 10 mM DTT, 50 mM KCl, 0.5 mM dTTP, 0.4 MBq/ml [3H]-dTTP, 0.4 mM polyA "oligo(dT)12-18


保存缓冲液
保存缓冲液组分:
50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.1 M NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM DTT, 0.1% (v/v) Triton X-100和50% (v/v)甘油。

5X RT缓冲液
250 mM Tris-HCl (pH 8.3, 25°C), 375 mM KCl, 15 mM MgCl2, 50 mM DTT。

质量控制
相关测试表明无内切和外切脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶、磷酸酶污染。 功能测试:第一链cDNA合成。

抑制与失活
  • 抑制剂:金属螯合剂、无机磷酸盐、焦磷酸盐和多聚胺。
  • 85°C热处理5分钟失活。


Maxima(R) Reverse Transcriptase在50°C的高热稳定性逆转录酶在1X反应缓冲液中孵育
图1。Maxima(R) Reverse Transcriptase在50°C的高热稳定性逆转录酶在1X反应缓冲液中孵育。
在标明的时间点(5-240分钟),酶的活性由标准活性分析确定。
二步RT-PCR 扩增长达20 kb 的目的片段
图2。二步RT-PCR 扩增长达20 kb 的目的片段。
1 ug从Jukat细胞(1和 )或者从小鼠(3和 4)中提取的总RNA在Maxima(R) Reverse transcriptase和其他逆转录酶的最佳反应条件时应用。合成的cDNA 在有Long PCR Enzyme Mix (#K0181)和不同基因的特定引物下作为PCR的模板:
1 – 6.8 kb POLE(人聚合酶)
2 – 9.4 kb FBN1(人原纤维蛋白1)
3 – 13.3 kb小鼠 distrophine蛋白
4 – 20.0 kb 小鼠nebuline蛋白
M – GeneRulerTM 1 kb Plus DNA Ladder (#SM1331)
在宽温度范围高通量合成cDNA
图2。二步RT-PCR 扩增长达20 kb 的目的片段。
1 ug从Jukat细胞(1和 )或者从小鼠(3和 4)中提取的总RNA在Maxima(R) Reverse transcriptase和其他逆转录酶的最佳反应条件时应用。合成的cDNA 在有Long PCR Enzyme Mix (#K0181)和不同基因的特定引物下作为PCR的模板:
1 – 6.8 kb POLE(人聚合酶)
2 – 9.4 kb FBN1(人原纤维蛋白1)
3 – 13.3 kb Dmd (小鼠 distrophine蛋白)
4 – 20.0 kb Neb (小鼠nebuline蛋白)
M – GeneRulerTM 1 kb Plus DNA Ladder (#SM1331)
50°C时的高cDNA 合成率
图4。50°C时的高cDNA 合成率。
以1ug 的7kb RNA转录物为模板在15,30和60分钟合成33P 标记的cDNA。反应产物在1%的碱性琼脂糖中解析。只有Maxima(R) RT 能够在5分钟内合成7 kb的转录物。
采用Maxima(R) Reverse Transcriptase 的可重复性的R-qPCR结果
图5。采用Maxima(R) Reverse Transcriptase 的可重复性的R-qPCR结果。
100ng-1pg的总 Jurkat 细胞RNA,oligo(dT)18 和随机六聚体混合物,与Maxima(R) RT一起用于16个可以重复的反应中。合成的 cDNA在ABI 7500 Real-Time PCR仪上用作后续的的含有Maxima(R) SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (#K0221) 的qPCR 反应的模板。采用Maxima(R) RT的平行反应显示在宽范围的RNA起始量内呈现可重复的cDNA合成和低变化水平(<1% SD/Cq)。
(完)

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